Variabilité des huiles essentielles et de l’ADN de deux souches de Mentha spicata L. (glabre et pubescente) de la région de Meknès

Résumé

Mentha spicata constitue l’une des 4 espèces du genre Mentha cultivées pour, entre autres, la production d’huiles essentielles. Les parcelles de la menthe connaissent l’apparition d’une souche pubescente (S_p.) suite à la germination des graines produite par la souche glabre (S_g.), initialement cultivée dans la région de Meknès. Pour comparer ces deux souches de M. spicata, des analyses chimiques des composés volatils et génétiques ont été entreprises. Les huiles essentielles ont été extraites par hydrodistillation des feuilles sèches et leur composition chimique a été analysée par CPG/SM. Le polymorphisme de l’ADN des deux souches a été caractérisé par l’AFLP (Amplified fragment polymorphism technique). Les rendements en huiles essentielles de S_p. et S_g. sont, respectivement, de l’ordre de 1,61 et 2,32% (v/w). Les nombres de composés chimiques identifiés chez la S_p. et la S_g. sont respectivement de 47 et 37. La souche S_p. se démarque par sa richesse en limonène (7,7%) et gemacrène-D (3,12%) et sa faible teneur en carvone (62,2), comparativement à la souche cultivée (75,6). La souche S_p. est caractérisée par 44 bandes uniques et la S_g. n’en possède que 18.

 Mots clés : Mentha spicata, Huiles essentielles, CPG/SM, ADN, AFLP, Polymorphisme

Introduction

Mentha spicata L. est un hybride interspécifique fertile issu du croisement de M. suaveolens et M. longifolia (Harley et Brighton, 1977; Gobert et al., 2002). Plusieurs variétés et hybrides de cette espèce (Gobert et al., 2002; Shasany et al., 2005; Hua et al., 2011; Hua et al., 2013) sont cultivés ou poussent à l’état spontané sur les 5 continents sauf l’Antarctique (Kokkini et Vokou, 1989; Gobert et al., 2002; Liu et Lawrence, 2007; Tucker Arthur et Naczi Robert, 2007). M. spicata est l’une des 4 espèces cultivées pour la production des huiles essentielles (Harley et Brighton, 1977). Les huiles essentielles de cette espèce sont utilisées dans plusieurs domaines d’importance économique (médecine, industrie alimentaire, pharmacie et phytoprotection) (Akdoan et al., 2007; Znini, 2011).

L’origine parentale de M. spicata lui confère une grande diversité morphologique, cytologique, génétique et chimique (Kokkini et Vokou, 1989; Gobert et al., 2002). Parmi ses populations, il peut y avoir des individus glabres et d’autres pubescents (Harly, 1967, cité dans Gobert et al., 2002). La présence de souches pubescentes constitue un matériel végétal recherché par les améliorateurs de plantes (Ashouri et al., 2001; Pomponb et al., 2010). Les poils constituent un système de défense contre des bioagresseurs comme les pucerons (Ashouri et al., 2001; Moghadam et al., 2013), ravageurs de M. spicata (Özdemýr, 2006; Kaygin et al., 2009). Par ailleurs, certains terpenoides comme le limonène, α-Pinene, β-Pinene, (E)-β-ocimene et germacrene D sont utilisés par les plantes comme système de défense contre les bioagresseurs, dans l’activation de l’expression des gènes de défense ou pour l’attraction des parasitoïdes et prédateurs des ennemis de cultures (Bohlmann et al., 1997; Fäldt et al.; 2003; Boachon et al., 2018; Li et al., 2021).

Le chimio-phénotype, le phénotype et le rendement des huiles essentielles des plantes sont affectés par les facteurs endogènes, dont le génotype de la plante (Murray, 1960; Kokkini et Vokou, 1989; Kokkin, 1991; Marks, 1997; Özgüven et Kirici, 1999; Boachon et al., 2018; Bornowski et al., 2020). La connaissance de la diversité génétique d’une plante fournit une base pour la sélection de cultivars très performants (Schlotterer, 2004). Pour ce faire, différentes techniques moléculaires sont utilisées pour évaluer la diversité génétique de la menthe (Vos et al., 1995; Khanuja et al., 2000; Fenwick et Ward, 2001; Shasany et al., 2005; Hua et al., 2011; Al-Rawashdeh, 2011; Hua et al., 2013). Pour M. spicata, la diversité génétique intra-spécifique a été étudiée par, entre autres, l’AFLP. Au Maroc, la caractérisation moléculaire de M. spicata seule ou en association avec celle des composés volatils n’a jamais fait, à notre connaissance, l’objet d’étude.

Cette étude se propose de comparer la variabilité chimique des huiles essentielles et génétique de deux souches de M. spicata, l’une glabre (Sg) initialement cultivée et l’autre pubescente (Sp) issue de la germination des graines de la souche (Sg), au sein d’une même parcelle située dans la région de Meknès.

Matériel et méthodes

Caractérisation morphologique de la souche Sg et Sp de M. spicata

La souche Sp de M. spicata est collectée d’une parcelle cultivée par la souche Sg de la même espèce dans la région de Meknès. Hormis la pubescence chez la souche à poils, les autres caractères morphologiques sont semblables chez les deux souches. L’identité des deux souches a été confirmée par le professeur Ibn Tattou Mohamed (Institut Scientifique de Rabat, Maroc où des échantillons sont déposés dans l’herbier de l’Institut, respectivement, sous les RAB 78287 et 78288 (Figure 1).

Matériel végétal

Trois kilogramme/souche de tiges feuillées fraîches de M. spicata ont été récoltés en juillet 2016 de la même parcelle, située dans la région de Meknès et de coordonnées géographiques (N: 33.898846; O: 5.634463), d’altitude 550 m et de climat semi-aride à hiver tempéré.

Les plants ont été séchés à l’ombre à une humidité relative comprise entre 37 et 65 % et à une température ambiante inférieure à 29 °C jusqu’à la stabilité du poids. Les feuilles ont été ensuite séparées des tiges et conservées au frais.

Extraction des huiles essentielles

Cent grammes de feuilles séchées de chaque souche ont été soumis à une hydro-distillation dans 500 mL d’eau distillée pendant 3 heures à l’aide d’un appareil de type «Clevenger». Les huiles essentielles recueillies par décantation à la fin de la distillation ont été déshydratées au sulfate de sodium anhydre et conservées dans des flacons en verre fumé dans un réfrigérateur à 4°C. Le rendement en huiles essentielles est exprimé en ml d’huiles par 100 g de broyat des feuilles sèches.

Analyse des huiles essentielles

L’analyse chimique des huiles essentielles a été effectuée par la technique de chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CPG/SM). L’appareillage utilisé est un chromatographe de type Trace GC ULTRA, équipé d’une colonne VB-5 (Methylpolysiloxane à 5% phenyl), 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm. Le spectromètre de masse est de type Polaris Q MS à trappe ionique. L’énergie d’ionisation est de 70 eV. La gamme de balayage s’étend de 50 à 500 m/z; 1µL d’une solution de 6 mg d’huiles essentielles dans 1,5 mL d’acétate d’éthyle a été injecté en mode split avec un ratio 1/50. Le gaz vecteur est l’hélium avec un débit de 1,4 mL/min. La température de l’injecteur et celle de ligne de transfert sont respectivement de 220 °C et de 300°C. La température de la source d’ionisation est 200°C. La température du four a été programmée comme suit : un isotherme à 40°C pendant 2 minutes, ensuite la température passe à 180°C à raison de 4°C/min puis à 300°C à raison de 20°C/min et un isotherme à 300°C pendant 2 minutes. L’identification des constituants des huiles essentielles a été faite sur la base des spectres de masse et de leurs indices de rétention (AI) au sens d’Adams (Adams, 2007) qui sont calculés à partir du temps de rétention d’une série d’alcanes (C8-C40). Les spectres et les AI sont comparés à ceux de la base de données (NIST, Version 2.0, 2002) et ceux cités dans la littérature (Adams, 2007; Padalia Rajendra et al., 2013).

Extraction de l’ADN

Les feuilles des deux souches de la menthe M. spicata (Sg et Sp) ont été conservées dans l’azote liquide à 80°C. Pour chaque souche, 200 mg de feuilles ont été broyés en une pâte fine dans environ 500 μL de tampon CTAB (bromure d’hexadécyltriméthylammonium). Après l’incubation du mélange dans un incubateur à 55°C pendant 15 min, celui-ci a été centrifugé à 12000 tr/min pendant 5 min. Pour chaque tube, 250 μL du mélange du chloroforme et de l’alcool isoamyle (24:1) ont été ajoutés. La solution finale a été mélangée puis tournée à 13000 tr/min pendant 1 min et la phase aqueuse supérieure contenant l’ADN a été transférée seule dans un microtube. Pour chaque microtube, 50 μL d’acétate d’ammonium 7,5 M, puis 500 µl d’éthanol absolu froid ont été additionnés et les microtubes inversés lentement à plusieurs reprises pour précipiter l’ADN. Après sa précipitation, l’ADN a été prélevé à la pipette puis lavé dans un microtube contenant 500 μL d’éthanol à 70% sous forme de glace et les tubes ont été lentement inversés et ensuite tournés à 13000 tr/min pendant une minute pour former une pastille. Après l’élimination du surnageant, l’ADN a été lavé 2 fois par l’ajout de d’éthanol à 70% sous forme de glace et ensuite tourné à 13000 tr/min pendant 1 min. La qualité et la quantité de l’ADN obtenu ont été mesurées par un spectrophotomètre à 260/280 nm. L’ADN a été séché pendant 15 min puis repris dans l’eau ultra pure.

Analyse de la variation génétique

Les amorces utilisées dans cette étude proviennent du kit AFLP d’Applied Biosystem (ABI, USA). Dans le présent travail, six combinaisons d’amorces AFLP (EcoRi-ACA/M- CTC, EcoRi-AGG/M-CTG, EcoRi-AGC/M-CTG, EcoRi-ACA/M-CAG, EcoRi-AAG/M-CTA et EcoRi-AGC/M-CTA) ont été utilisées. Les différentes étapes d’ALFP suivies sont décrites dans le manuel fournis avec le Kit (AFLP®, 2010).

Analyse des données

Les bandes non ambiguës de longueurs comprises entre 0 et 500 pb dans l’analyse AFLP ont été marquées. Ensuite, les résultats des profils d’amplification ont été transformés en une matrice par l’attribution du chiffre 1 à des bandes présentes et 0 à des bandes absentes. La similarité génétique a été estimée par le coefficient de similarité (Nei et Li, 1979), tandis que la diversité de la composition des huiles essentielles des deux souches a été évaluée par la distance euclidienne au moyen du logiciel Excel version 2007.

Résultats et discussion 

Rendement des huiles essentielles

Le rendement en huiles essentielles des feuilles de la souche Sg (2,32 % v/w) est supérieur à celui de la Sp (1,62% v/w); cette différence peut être attribuée aux facteurs endogènes dont le génotype des souches de M. spicata. En effet, selon (Kokkini et Vokou, 1989; Kokkini, 1991; Özgüven et Kirici, 1999), l’accumulation des huiles essentielles est affectée par le génotype des plantes et le rendement de ces huiles varie d’un hybride à l’autre ou d’une souche à l’autre (Farah et al., 2002; Rey et al., 2004; Soilhi et al., 2019).

Composition des huiles essentielles

L’analyse de la composition chimique montre une variation en quantité et en qualité du profil chimique des huiles essentielles étudiées. Selon la souche étudiée, 93,9 et 94,3 % des constituants des huiles essentielles de M. spicata sont identifiés (Tableau 1).

Ce qui correspond à 37 et 47 composés relevés dans l’échantillon, respectivement, de la souche Sg et Sp Les composés identifiés sont principalement les monoterpènes oxygénés qui représentent environ 71% dans Sp et 85% dans Sg des composés des huiles essentielles. Avec 62% dans Sp et 76% dans Sg, le carvone constitue le composé majoritaire; dans la littérature, plusieurs auteurs ont remarqué que M. spicata est aussi riche en carvone (Edris et al., 2003; Chauhan et al., 2009; Hua et al., 2011; Znini et al., 2011; Govindarajan et al., 2012; Hua et al., 2013; Soilhi et al., 2019). La composition en huiles essentielles des hybrides connaît une variation (Farah et al., 2002; Rey et al., 2004) néanmoins leur chémotype reste le même (Rey et al., 2004). Les monoterpènes hydrocarbonés et les sesquiterpènes hydrocarbonés sont plus représentés chez la Sp avec, respectivement, de 11,0 et 7,59 %; tandis que la Sg est pauvre en ces groupes (Tableau 1). Le limonène (7,82 %) est le composé le plus représenté du groupe des monoterpènes hydrocarbonés chez la souche Sp Récemment, l’accession [IIIM(J) 26] de M. spicata riche en carvone (76,6 %) et en limonène (9.57%) a été sélectionnée (Chauhan et al., 2009). La variabilité en pourcentage de limonène et carvone peut s’expliquer par l’activité de limonène synthétase, limonène-6-hydroxylase et trans-carveol dehydrogenase (Gershenzon et al., 1992; Bouwmeester et al., 1998) qui sont affectées par la régulation de l’expression des gènes sous l’influence de facteurs endogènes (Bohlmann et al., 1997; Bouwmeester et al., 1998; Croteau Rodney et Colby Shelia, 1999; Fäldt et al., 2003). Par contre, le germacrène D est la plus représenté dans le groupe des sesquiterpènes hydrocarbonés et représente 3,17% des composés volatils chez la même souche (Sp). Cette variabilité peut être due à l’activité enzymatique des sesquiterpènes synthétases impliquées dans la transformation du geranyl diphosphate en sesquiterpènes hydrocarbonés et oxygénés (Degenhardt et al., 2009; Nieuwenhuizen et al., 2009). Certains auteurs ont pu isoler la (+)-germacrène D synthétase du gingembre (Zingiber officinale) (Picaud et al., 2006). D’autres ont montré la synthèse du germacrène D à partir du farnesyl pyrophosphate (FPP) à l’aide de la germacrène D synthétase (Gershenzon et al., 2000). La variabilité de la composition des huiles est attribuée aux différents niveaux de la biosynthèse des enzymes responsables (Gershenzon et al., 2000).

Les 12 composés volatils spécifiques à la Sp sont les α-Thujene, Camphene, β-Pinene, meta-Mentha-1(7), 8-diene, α-Terpinene, (Z)-β-Ocimene, (E)-β-Ocimene, Terpinolene, trans-Piperitol, cis-Jasmone, Spathulenol et cis-14-nor-Muurol-5-en-4-one. Ceux-ci représentent 1,99% du total. Par contre, dans les huiles essentielles de la Sg, seuls 2 composés sont spécifiques à savoir les ρ-Mentha-1(7),8-diene et Germacra-4(15),5,10(14)-trien-1α-ol. Ils représentent 0,26 % du pourcentage identifié. La variabilité dans la composition en huiles essentielles des deux souches est aussi corroborée par la distance de dissimilarité avoisinant 14,9. Dans le cas des accessions étudiées par (Hua et al., 2011), la distance de dissimilarité varie entre 0,01 et 11,3. Plusieurs auteurs ont aussi noté une variabilité dans la composition chimique des huiles essentielles des accessions étudiées de M. spicata (Kokkini et Vokou, 1989; Edris et al., 2003; Hajlaoui et al., 2008; Chauhan et al. 2009; Znini et al., 2011; Hua et al., 2011; Hua et al., 2013; Soilhi et al., 2019). La différence dans les constituants de ces huiles peut être affectée par des facteurs liés à l’espèce elle-même (eg, anatomique, biochimique et physiologique).

Évaluation moléculaire

L’étude de la diversité moléculaire des souches Sp et Sg par l’AFLP a permis d’amplifier 109 bandes. La longueur des fragments marqués varie de 36 à 492 pb avec une moyenne de 18 bandes par marqueur primaire et dont 56,9% sont polymorphes. La souche Sp est génétiquement plus diversifiée que la Sg, les nombres totaux des bandes uniques sont 44 et 18, respectivement chez Sp et Sg. Ce nombre de bandes uniques varie de 0 à 20 en fonction de l’amorce utilisé (Tableau 2).

La variation du nombre de bande unique chez M. spicata CIMAP/C30, M. spicata CIMAP/C33 et leur hybride a été montré selon l’amorce choisi par (Shasany et al., 2005). Le polymorphisme est aussi mesuré par le coefficient de similarité s’élevant à 0,61. Nos résultats concordent avec ceux trouvés par certains auteurs (Gobert et al., 2002; Khanuja et al., 2000; Al-Rawashdeh, 2011). Les coefficients de similarité de la diversité génétique intra-spécifique de M. spicata calculés par ces auteurs oscillent, respectivement, entre 0,61 et 0,98; 0,59 et 0,64 et entre 0,11 à 0,68. A l’instar des accessions de M. spicata mentionnées dans certaines études (Al-Rawashdeh, 2011; Hua et al., 2011), les 2 souches de M. spicata étudiées ne présentent pas une grande diversité génétique.

La présence de poils et la variabilité des huiles essentielles entre les deux souches peuvent être d’origine génétique. Comme cela a été mis en évidence chez le lavandin (Lavandula × intermedia Emeric ex Loiseleur) génétiquement modifié et chez Arabidopsis (Marks, 1997; Tsuro et Ikedo, 2011). D’ailleurs, une relation entre le génotype de la plante, la biosynthèse des enzymes responsables et le métabolisme des monoterpènes et les sesquiterpènes a été montrée (Ringer et al., 2005; Boachon et al., 2018; Bornowski et al., 2020). Chez M. spicata, le gène C dominant est responsable de la production de la carvone à partir du limonène et le gène Lm dominant inhibe la conversion du limonène à la piperitènone avec une faible conversion de la carvone en carveol en absence du gène R (Bhat et al., 2002). A ce propos, les huiles essentielles des individus de M. aquatica possédant le gène dominant Lm et récessif cc sont riches en limonène, tandis que celles des plantes du génotype (LmLm, CC) sont riches en carvone (Hefendehl et Murray, 1972; Hefendehl et Murray, 1973). Certains auteurs ont isolé et séquencé l’ADN codant pour l’enzyme (-)-4S-limonène synthase de M. spicata (Croteau Rodney et Colby Shelia, 1999). D’autres travaux relatifs à l’isolement de séquences d’ADN codant pour les enzymes synthétases des monoterpènes, sésquiterpènes et les diterpènes sont cités dans la littérature (Bohlmann et al., 1997; Maruyama et al., 2001; Lücker et al., 2002; Ohara et al., 2003; Fäldt et al., 2003; Picaud et al., 2006; Nieuwenhuizen Niels et al., 2009; Bornowski et al., 2020; Li et al., 2021).

Conclusion 

À travers les résultats obtenus, les deux souches de M. spicata présentent une variabilité génétique et en termes de composition des huiles essentielles. La souche Sp est à la fois génétiquement plus diversifiée et riche en nombre de composés volatils. Chez les deux souches, la carvone est le composé majoritaire. Le limonène et le Germacrène-D sont plus représentés dans les huiles essentielles de la souche pubescente Sp Douze composés volatils sont spécifiques à cette dernière souche contre uniquement deux à la souche Sg Dans la présente étude, la diversité des composés volatils des deux souches semble être affectée par leurs génotypes. La caractérisation quantitative et qualitative des huiles essentielles des deux souches en association avec la diversité de l’ADN constitue donc une piste de recherche pour orienter la sélection et l’amélioration des cultivars appropriés de la menthe.

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