Evaluation semi-quantitative des lésions histopathologiques respiratoires chez la dinde moyennant un système de scoring lésionnel: Infection expérimentale par le virus de l’influenza aviaire faiblement pathogène H9N2

Résumé

Dans le cadre de l’étude de la pathogénicité et de l’évaluation de la vaccination du virus de l’Influenza Aviaire faiblement pathogène H9N2 chez la dinde ; une étude histopathologique des lésions engendrées par ce virus suite à l’infection expérimentale de la dinde a été réalisée.  Ainsi, 80 dindonneaux ont été mis en essai, et vaccinés contre H9N2 à 8 jours d’âge et le challenge à 26 jours. Un monitoring clinique a été effectué après le challenge, avec la réalisation de deux autopsies à 5 jours et à 10 jours post-challenge. Les dindonneaux ont manifesté des signes respiratoires avec des râles trachéaux, la toux, une sinusite avec des écoulements nasaux et oculaires mousseux, associés à des symptômes généralisés y compris l’entassement, la léthargie et un plumage ébouriffé. Des taux de mortalité de 50 et 20% ont été relevés respectivement chez le groupe de dindonneaux non vaccinés et vaccinés. Sur le plan lésionnel, une sinusite fibrineuse, une trachéite, et une aérosacculite fibrineuse ont été notés chez les deux groupes challengés, à moindre degré chez les vaccinés, avec une pneumonie fibrineuse détectée seulement chez les non vaccinés. L’étude histpathologique a révélé des lésions similaires à la fois chez les groupes vaccinés et non vaccinés à 5 et à 10 jours post-challenge, qui ne différent que par leur gravité. Ainsi un système de scoring de 4 grades (de 0 à 3) a été adopté pour évaluer les lésions trachéales chez les lots d’oiseaux étudiés, la comparaison de ceux-ci s’est basée principalement, sur l’évolution des grades et la précocité de retour à la normale (grade 0). Les lésions ont été plus sévères pendant l’autopsie de 5 JPC, une différence entre les groupes a été relevée, mais aucune différence statistique n’a été démontrée. En conclusion, le système de scoring procure des résultats cohérents ce qui prouve sa fiabilité en tant qu’outil supplémentaire dans les études expérimentales en pathologie aviaire. 

Mots-clés: Lésions Histopathologiques, scoring lésionnel, dinde, H9N2, infection expérimentale

Introduction

L’Histopathologie a été et est toujours utilisée pour le diagnostic des maladies infectieuses, dégénératives et néoplasiques en médecine humaine et vétérinaire (Klopfleisch, 2013). En outre, cette discipline est largement utilisée dans l’évaluation du pronostic des maladies tumorales. Le principe de cette évaluation repose sur la catégorisation de certaines modifications morphologiques microscopiques ayant des capacités prévisionnelles de l’évolution des néoplasmes. Autrement dit, des indicateurs pronostiques, comme: l’activité mitotique, la nécrose, le polymorphisme nucléaire et l’invasion vasculaire (Oliveira et Nascimento, 2001). Actuellement le scoring histologique est le moyen le plus pertinent dans l’évaluation du pronostic des sarcomes (Maretty-Nielsen et al., 2014 ; Oliveira et Nascimento, 2001). Par ailleurs, l’interprétation des lésions histopathologiques et leur scoring est fondamentale dans la caractérisation des dangers et l’évaluation du risque dans le domaine de la pharmacotoxicologie. Le scoring lésionnel est largement utilisé dans les études de toxicité non-clinique pour différencier l’effet du traitement des constatations initiales, ainsi que pour conclure sur l’innocuité et pour déterminer la dose susceptible de produire des effets indésirables des substances chimiques ou naturelles étudiées (Schafer et al., 2018). Le scoring histopathologique a aussi un potentiel scientifique et pratique non négligeable hors du contexte des néoplasmes et de toxicologie, notamment pour étudier et suivre l’évolution des processus inflammatoires et fibreux, afin d’investiguer et de comparer l’effet des différents traitements appliqués (Cross, 1998). L’évaluation de l’efficacité vaccinale en constitue un bon exemple. En effet, les études de la pathogénicité des agents infectieux aviaires reposent principalement sur les techniques de biologie moléculaire et de sérologie de plus en plus avec les progrès importants réalisés. Un résultat numérique et rapide est assuré, chose qui facilite sa présentation et sa communication aux lecteurs. Alors que l’histopathologie est réservée pour le diagnostic des pathologies engendrant des lésions spécifiques, chose qui est rare en pathologie aviaire. Dans la recherche, une description nominale est généralement attribuée aux lésions, et les prélèvements sont effectués lors d’une seule date. Nous estimons que l’adoption d’un système de scoring lésionnel peut constituer un atout précieux pour les études en pathologie aviaires. Par exemple dans l’étude de la pathogénicité des microorganismes qui affectent la volaille, l’étude de la sensibilité relative des espèces de volaille vis-à-vis de ces pathogènes ; ainsi que dans le cadre de l’évaluation de l’innocuité de certaines substances comme les produits alternatifs aux antibiotiques promoteurs de croissance et des nouveaux adjuvants, et plus particulièrement dans l’étude de l’efficacité des vaccins. Le recours à ce système de scoring lésionnel permet également d’évaluer la précocité du retour des tissus et des éléments histologiques étudiés à la normale, ce qui constitue un élément crucial pour juger et comparer les traitements/ lots/ substances étudiées. De plus, la facilité d’interpréter, de comparer, et de communiquer un score ou un grade lésionnel rend l’étude histopathologique plus pratique et plus aisée pour le manipulateur, surtout si le nombre de spécimens traité est élevé ; c’est en effet le cas des études de recherche en pathologie aviaire. La présente étude a été menée pour étudier l’effet pathogène du virus H9N2 chez la dinde et pour évaluer l’efficacité vaccinal contre celui-ci., A cet effet un système de scoring lésionnel a été adopté dans le cadre d’une approche comparative.

Matériel et méthodes

Locaux et installations

La forte contagiosité du virus de l’influenza aviaire entre les oiseaux, impose que chaque lot challengé soit séparé de ses homologues expérimentaux non challengés. De ce fait, nous avons disposé d’un bâtiment à l’unité de pathologie aviaire de l’Institut Agronomique et Vétérinaire (IAV) Hassan II pour les lots challengés par le virus H9N2 séparément des lots témoins non challengés, qui eux ont été maintenus dans un autre bâtiment à l’unité de parasitologie et maladies parasitaires. Les deux bâtiments sont éloignés l’un de l’autre d’une distance de plus de 300 mètres. Les oiseaux ont été entretenus par différentes personnes pour éviter la contamination des lots témoins. Des mesures de biosécurité strictes ont été exigées (usage des pédiluves, désinfection des mains, changement de bottes avant chaque franchissement, …). La qualité de la protection sanitaire est vérifiée par le maintien des lots contrôles parfaitement indemnes de l’influenza aviaire tout le long de l’expérimentation (preuve sérologique : Bidoudan., 2017).

Matériel biologique

Oiseaux

Un nombre de 80 dindonneaux ont été élevés à l’unité de pathologie aviaire à l’IAV Hassan II, celui-ci est reconnu indemne de maladies spécifiques : colibacillose, pullorose, et provient de parentaux vaccinés contre le virus de l’influenza aviaire faiblement pathogène H9N2. Les oiseaux ont reçu l’eau de boisson et l’aliment ad-libitum pendant toute la période de l’expérimentation, avec un aliment Commercial adapté à la durée de l’élevage.

Vaccin

Les oiseaux ont été vaccinés suivant le protocole ci-dessous :

• Vaccination par voie oculaire contre la rhinotrachéite infectieuse de la dinde (TRT) et la maladie de Newcastle (NDV) à un jour d’âge moyennant des vaccins vivants atténués.

• Vaccin inactivé bivalent contenant le virus de l’influenza aviaire faiblement pathogène H9N2 et la souche Ulster 2C du virus de la maladie de Newcastle NDV à 8 jours d’âge par voie intramusculaire.

Virus

La souche marocaine du virus de l’influenza aviaire faiblement pathogène H9N2 A/chicken /Morocco/SF1/2016 (access number LT598532) utilisée, a été aimablement fournie par la division de la pharmacie et des et intrants vétérinaires (DPIV-ONSSA-Maroc). A 26 jours d’âge, chaque oiseau a reçu une dose de 0.2 ml du virus H9N2, à une dose de 107 EID50 (Embryo infectious dose). L’inoculation a été effectuée par voie occulo-nasale par des seringues de 1 ml distribuées sur 5 sujets.

Protocole expérimental

Afin de mimer les conditions du terrain et potentialiser la manifestation clinique de H9N2 pour enfin arriver à une explication des dégâts rapportés dans le terrain, nous avons adopté le protocole expérimental consigné dans le tableau 1 ci-dessous.

Tableau 1: Protocole expérimental de l’essai de la dinde

Techniques histologiques

Deux autopsies ont été programmées pour chaque étude, à 5 et à 10 jours post-challenge, pour relever les lésions macroscopiques et prendre des prélèvements pour l’étude histopathologique. Des portions de 5 cm de la trachée ont été prélevées et mises dans une solution de formol 10% neutralisé pour la fixation. La déshydratation est effectuée moyennant des bains d’alcool de concentration croissante (70%, 95%, 100 %). L’inclusion est faite à la paraffine et les coupes sont effectuées à 5 microns. Ensuite une coloration classique à l’hématoxyline-éosine (H&E) a été réalisée.

Analyses statistiques

Les résultats obtenus ont été traités par le test exact de Fisher en utilisant le logiciel SPSS@

Résultats 

Signes cliniques et mortalités

Les dindonneaux âgés de 26 jours, non vaccinés et infectés par voie oculo-nasale par la souche marocaine du virus H9N2 (Lot B), ont montré des signes cliniques à partir du premier jour post-challenge et qui ont persisté jusqu’au 9ème jour.

5 dindonneaux ont été trouvés morts au cours de l’essai. Les mortalités ont commencé le 7ème JPC avec un pic au cours du 9ème JPC, le taux de mortalité enregistré pour ce lot est de 50%. Les signes cliniques manifestés par les dindonneaux consistent en une toux, des éternuements, des râles trachéaux et bronchiques, une léthargie, un entassement des oiseaux et un plumage ébouriffé. En plus des symptômes respiratoires, quelques oiseaux ont présenté une sinusite associée à des écoulements oculaires et nasaux mousseux, entre le 3ème et le 8ème JPC. Les dindonneaux qui ont été vaccinés contre H9N2 et challengés (Lot A), ont présenté des signes de dépression et des râles trachéaux et bronchiques entre le 3ème et le 5ème JPC. Ces signes cliniques manifestés par les sujets du lot A sont similaires, mais moins sévères que ceux observés chez le lot B, et se sont également étalés sur une période plus courte. Le taux de mortalité noté chez ce groupe est de 20% à partir du 7ème JPC.

Lésions macroscopiques

L’examen nécropsique a révélé des lésions limitées à l’appareil respiratoire. Les lésions détectées à 5 jours post-challenge sont plus variées et plus sévères. Les lésions consistent en: une sinusite fibrineuse, une trachéite, une pneumonie fibrineuse, et une aérosacculite fibrineuse. A 10 JPC, le reste des oiseaux ont été sacrifiés et une deuxième autopsie a été réalisée. Les lésions observées sont moins sévères avec seulement des cas de sinusite fibrineuse, aérosacculite fibrineuse et un épaississement des sacs aériens (figure 1). Aucune lésion n’a été relevée chez les oiseux non challengés euthanasiés (Lots C et D).

Figure 1: Distribution des lésions macroscopiques chez les dindonneaux du lot A (vacciné et challengé) et du lot B (non vacciné et challengé).

Lésions microscopiques

Trachée

Les lésions histopathologiques au niveau de l’épithélium trachéal ont été évaluées, des scores lésionnels en ont été attribués selon les critères suivants:

• Au niveau de l’épithélium : la présence ou l’absence de la ciliature, des cellules caliciformes, l’hyperplasie et la métaplasie.

• Au niveau du chorion: l’épaississement, l’œdème, la congestion, l’infiltration lympho-histiocytaire.

Suivant le système de notation qui suit:

A: Score 0 Trachée normale Epithélium de type cylindrique, pseudo-stratifié et cilié avec des cellules caliciformes. Le chorion est formé d’un tissu conjonctif lâche. La sous- muqueuse contient des vaisseaux sanguins et un tissu lymphoïde sous forme de lymphocytes dispersés. Le périchondre et le cartilage trachéal. (H&E)

B: Score 1 Une Structure épithéliale normale présentant des lésions focales: vaisseaux sanguins hyperémiés ; une déciliation focale, une Infiltration lympho-histiocytaire légère, un épaississement de la lamina propria, et une diminution de nombre des cellules caliciformes (H&E)

C: Score 2 Vaisseaux congestionnés, Infiltration lympho-plasmo-histiocytaire diffuse associée à une déciliation importante, raréfaction des cellules caliciformes, un épaississement de la lamina propria, et une hyperplasie épithéliale. (H&E) D: Score 3 en plus des lésions précédentes : une métaplasie, absence de glandes et de cellules ciliées (disparition totale des cellules spécialisées de l’épithélium), associée à une hyperplasie épithéliale importante. (H&E)

Figure 2 (A, B, C, D): Système de scoring des lésions trachéales engendrées par le virus H9N2 chez la dinde (H&E).

Les résultats du scoring des lésions trachéales, des sujets autopsiés et analysés, sont présentés dans le tableau 3 ci-dessous:

Tableau 3: Résultats numériques du scoring des lésions trachéales chez la dinde

Discussion

Le virus de l’influenza aviaire faiblement pathogène H9N2 a été isolé pour la première fois aux Etats Unis à partir d’un élevage de dinde en 1966 (Homme et Easterday, 1970). Mutinelli et al., (2003) et Alexander (2000) ont remarqué pendant leurs enquêtes épidémiologiques que la sensibilité de la dinde vis-à-vis du virus de l’influenza aviaire est accrue, ce qui explique, en effet, les signes cliniques prononcés et le taux de mortalité élevé rapportés lors de cette étude. Les manifestations cliniques ont été variés et se sont aussi étalées sur une grande partie de la période d’observation (les râles, l’œdème facial, l’abattement…). En plus une mortalité de 50 % a été notée chez le lot d’oiseaux non vacciné et challengé et de 20 % chez celui vacciné et challengé. Les lésions macroscopiques sont limitées à l’appareil respiratoire, avec une incidence plus forte chez le lot non vacciné, ces lésions ont été détectées aussi bien à 5 et à 10 JPC. L’étude des lésions histopathologiques de la trachée, en tant qu’organe cible du virus, a révélé une trachéite caractérisée par une déciliation, une raréfaction des cellules caliciformes, une infiltration lympho-plasmo-histiocytaire, et une métaplasie malpighienne des cellules épithéliales, relevée avec une variation de la gravité chez tous les lots. Les lésions tendent à être plus graves et plus diffuses chez les individus autopsiés à 5 JPC, à la fois chez les lots vaccinés et non vaccinés. Des résultats similaires ont été rapportés par Stipkovits et al. (2012) suite à une étude de co-infection du virus de l’influenza aviaire faiblement pathogène H3N8 et Mycoplasma gallisepticum, avec des lésions plus graves chez les oiseaux qui ont été challengés par les deux pathogènes comparativement à ceux challengés par le virus ou le mycoplasme seul. Gharaibeh (2008) et Habl et al. (2004) ont aussi rapporté une trachéite lymphocytaire lors de leurs études sur la pathogénicité du virus H9N2. A 10 JPC, les deux lots A et B (vaccinés et non vaccinés) ont montré une récupération totale avec retour à la normale de la structure trachéale. L’étude statistique a montré qu’il n y’a aucune différence significative entre les deux lots challengés, vaccinés ou pas. Afin de pouvoir comparer les lots et conclure sur la capacité du traitement (vaccin dans cette étude) à réduire les lésions « significativement », l’utilisation du système du scoring ne peut pas avoir lieu seule sans paramètres et conditions strictes de standardisation et de réduction des facteurs de variabilité entre les lots (Crissman et al., 2004; Cross, 1998; Gibson-Corley et al., 2013) ; cela veut dire tous les autres facteurs qui pourraient interférer avec le traitement et causer des changements qui peuvent être interprétés comme étant dus au traitement. Ces facteurs comprennent ceux qui sont liés à l’animal, l’opérateur, le matériel, l’environnement, et puis la méthode. Pour ceux qui sont liés à l’animal, il faut mener l’étude chez des animaux de la même espèce, souche, âge (Burkhardt et al., 2011) et provenant du même lot, puisque la vaccination des parentaux et le taux des anticorps d’origine maternels interférent avec la vaccination effectuée avant 10 jours d’âge (De Vriese et al., 2010). En ce qui concerne l’environnement, par exemple, des mauvaises conditions d’entretien, un accès limité à l’eau et un taux élevé d’ammoniac au niveau des locaux d’hébergement, peuvent induire chez un lot d’oiseaux des mortalités accrues et des signes cliniques., A l’autopsie, une hypertrophie rénale et une congestion trachéale plus sévères seraient notées chez ces individus, ce qui va évidemment se répercuter sur les conclusions de l’étude. Sur le plan nécropsique, l’autopsie des cadavres d’oiseaux doit obligatoirement être signalée, afin de prendre en considération le biais de l’autolyse post mortem. L’endroit de la coupe histologique (la méthode) doit aussi être standardisé, par exemple pour la trachée, le nombre des glandes caliciformes diminuent en allant vers la bifurcation trachéale, par conséquent il ne faudrait pas comparer deux sections prises sur deux endroits différents, surtout que la diminution et l’hyperplasie des cellules caliciformes peut se rapporter à une réponse locale au niveau de la trachée (Fletcher, 2008). Il serait également important de s’assurer de la bonne qualité de la fixation et de la coupe de tous les spécimens pour pouvoir les interpréter, leurs attribuer des scores, et finalement les comparer (Gibson-Corley et al., 2013) . La lecture des coupes histologiques a été effectuée par un opérateur, de manière anonyme « blinding ». Cette méthode est utilisée dans les essais cliniques en médecine humaine pour éviter l’effet placebo chez le patient et le médecin (Day and Altman, 2000;Burkhardt et al., 2011). Parallèlement, dans la recherche, les attentes de l’équipe de l’étude par rapport à un traitement ou un lot pourraient constituer un véritable biais cognitif. La lecture anonyme ou le « blinding/masking » pourrait se faire en histopathologie en désignant une personne externe à l’étude qui attribue des codes pour les groupes, ou simplement en masquant le code des lames et les mélanger avant la lecture. Plusieurs études en pathologie aviaire ont utilisé des systèmes de scoring (Fletcher et al., 1976; Mo et al., 1997; Stipkovits et al., 2012), ce qui témoigne de l’efficacité des scores notamment pour la comparaison et la communication des résultats aux lecteurs ; une valeur numérique est attribuée aux modifications cellulaires après l’interprétation des lésions, ce qui facilite la manipulation des données, plus particulièrement pour les statistiques, et la communication de celles-ci. Néanmoins, le scoring lésionnel doit adhérer à un protocole bien établi, qui vise à diminuer les biais de variabilités intra et inter-observateurs, afin d’assurer une bonne reproductibilité du système adopté tels que le fait de standardiser les endroits de prélèvements, la préparation et la lecture des coupes histologiques. Il est aussi préconisé qu’un ou deux autres opérateurs fassent le scoring pour faire des statistiques Kappa et s’assurer de la reproductibilité du système de scoring (Cross, 1996 ; Furness et al., 2003). Le présent travail de recherche constitue la première étude de pathogénicité du virus de l’IAFP H9N2 chez la dinde au Maroc ; l’équipe a pu démontrer la sensibilité accrue de cette espèce vis-à-vis de la souche marocaine de l’influenza aviaire H9N2 ; il a aussi contribué à l’étude de l’évaluation de l’efficacité vaccinale contre ce virus, parmi d’autres techniques. En conclusion, le vaccin a réduit la gravité du tableau clinique et lésionnel, il a aussi réduit le taux de mortalité de 30%, cependant, le scoring lésionnel trachéal n’a pas montré de différences significatives entre les lots d’oiseaux étudiés. Les discordances entre les résultats de l’histopathologie et les lésions macroscopiques peuvent être dues à une insuffisance de l’échantillon, la trachée seule n’est pas représentative de l’état des oiseaux. Une étude histopathologique de l’ensemble des organes atteints (poumons, sacs aériens, sinus) et potentiellement ayant des lésions microscopiques (reins, rate, intestins, foie, et pancréas) est préconisée pour pouvoir conclure sur le plan microscopique.

Références

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